点击图片查看原图
一、细胞复苏
从液氮中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中解冻至管内残留一点冰屑。用75%酒精擦拭冻存管后，将内容物吸至一15ml无菌离心管中，逐滴加入预温至37℃的RPMI-1640培液4－5ml混匀，室温1500rpm离心10分钟弃上清。再用RPMI-1640培液4－5ml洗涤一次，离心后弃上清，加HUVEC完全培养液4－5ml备用，每支HUVEC冻存管含细胞量为5×10个。
二、细胞接种和培养
参考：www.ecbm.cn1、细胞接种：
（1）、包被液：用去离水配制0.5%明胶溶液，过滤除菌。
（2）、培养瓶包被：取2-4个T25培养瓶，每个培养瓶加2－3ml0.5%明胶溶液，摇匀使包被液布满培养瓶底面，置37℃2小时或放置过夜。
（3）、接种细胞：接种前吸净包被液，按2500－5000个细胞/cm接种细胞（1支5×10个细胞可接种2-4个培养瓶），每瓶加培养液3-5ml,摇匀后置37℃5%CO2培养箱内培养24小时，此时细胞已完全贴壁，更换培养液后继续在37℃5%CO2培养箱内培养。
（4）、扩大培养：一般每周更换培养液2次，至细胞长至覆盖培养面的70-80%可进行传代或冻存。
三、消化细胞
消化液：用pH7.0-7.2的PBS或D-Hank’S液，分别配制0.25%胰酶液和0.02%EDTA-Na2液，用前按1：1混合。在细胞传代或冻存前先消化细胞。具体操作如下：吸净培养液，每瓶加消化液1ml，摇匀使其布满培养瓶细胞面。37℃消化2-5分钟。显微镜下看细胞回缩成圆形后，轻轻震动使绝大部细胞脱落后，每瓶加含10%FBS的RPMI-1640液的中和液4-5ml中和胰酶的消化作用，并用吸管轻轻吹打培养面使细胞完全脱落后，吸至15ml无菌离心管内。4℃1500rpm离心10分钟弃上清，再用中和液洗涤细胞，离心弃上清，加适量RPMI-1640液，混匀后取10ul 细胞悬液加10ul台盼蓝混匀后作细胞计数，按需要做步骤四或五。
四、细胞传代
方法同步骤二。
方法同步骤二。
五、细胞冻存
调整细胞数2-5×10个/ml，按含细胞的RPMI-1640液ml数，配制等量的冻存液。冻存液中FBS占80%，DMSO占20%。例：含细胞的RPMI-1640液为8ml，应配冻存液8ml，其中FBS为6.4ml,DMSO为1.6ml，混匀。置细胞悬液于冰浴中，逐滴加入冻存液，边加边摇动。加完后用吸管吹打混匀。于冰浴中分装细胞于冻存管中，1.8ml/管，再将冻存管置于冻存盒内置-80℃冰箱，24小时后转入液氮中保存。
