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免疫荧光方法中主要步骤:
1)冰冻切片制备:建议用新鲜组织否则组织细胞内部结构破坏易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等防止裂片和脱片。
2)组织切片固定切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min,尤其要较长时间保存的白片,一定
要及时固定和适当保存。
3)血清封闭:为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合需要在一抗孵音前先用血清(与二抗来源一致)封闭减弱背暴着色，血清封闭的时间是可以调整的一般10-30min。
4)一抗孵音条件在免疫组化反应中最重要包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵查温度有几种4度、室温
37度其中4度效果更佳孵音时间这与温度、抗体浓度有关一般37度1-2h4度过夜(从冰箱拿出后37度复温45min)。具体条件还要摸索。
5)二抗孵育条件一般室温或37度30min-1h具体时间需要摸索而浓度一般有工作液若是浓缩液还要摸索浓度一定要避光反应，但在免疫荧光中我们一般先把三抗浓度和孵育时间先定下然后去摸索一抗浓度和邦育时间。最后荧光素标记的二抗随着保存时间的延长可能会有大星的游商荧光素残留需要注意配制时小包装和并进行适当的商心。
6)复染目的是形成细胞轮廊从而更好地对目标蛋白进行定位，一般常用DAPI复染
7)封片:为了长期保存我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角,接近封片液近端的拐角先降低直至接触到液体时为止当发现液体接触面在不断弥散时则可以缓慢降低另一拐角这样一般不会产生气泡。
8)切片清洗:为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色所以适当地加强清洗(延长时间和增多次数)尤为重要一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次而一抗孵育后的清洗均为5次*5min.
注意:
(1)单独冲洗,防止交叉反应造成污染
(2)温柔冲洗,防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式;
(3)冲洗的时间要足够,才能彻底洗去结合的物质。
(4)PBS的PH和离子强度的使用和要求(建议PH在7.4-7.6,浓度是0.01M;中性及弱碱性条件有利于免疫复合物的形成,而酸性条件则有利于分解;低离子强度有利于免疫复合物的形成,而高离子强度则有利于分解
9)拍照有条件的话更好立即拍照若不能及时拍照也要封好片和用指甲油封固,保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作不要随意改变程序应在暗室中进行检查防止紫外线对眼睛的摄害在调救光源时应戴上防护眼镜检查时间每次以1~2h为宜超过90min.超高压录灯发光强度逐渐下降荧光减弱标本受紫外线照射3~5min后荧光也明显减弱或褪色激发光长时间的照射,会发生荧光的衰减和淬灭现象:所以最多不得超过2~3h荧光显微镜光源寿命有限标本应集中检查，以节省时间,保护光源。天热时应加电扇散热降温新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时须待灯光充分冷却后才能点燃。中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后标本染色后立即观察因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚之烯塑料袋中4℃保存可延缓荧光减弱时间,防止封裱剂蒸发,使用的玻片等载体都必须厚度均匀无明显的自发荧光如果使用油镜还必须保证镜油为无荧光镜油电源更好装稳压器,否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命也会影响镜检的效果。
背景染色较深的原因有哪些?
1、抗体浓度过高一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化找到适合自己实验室的理想工作浓度既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。
2、抗体孵音时间过长或温度较高解决办法是严格执行操作规程更好随身佩带报时表或报时钟及时提醒避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法(Polymer)敏感性很高要求一抗孵育的时间不是传统的1小时而是30分钟因此要根据染色结果进行调整。
3、DAB变质和显色时间太长DAB更好现用现配如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长因为在没有酶的情况下过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色更好在显微镜下监控达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时这样做似乎不现实但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控避免显色时间过长。
4、组织变干修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细采用DAKO笔或PAPPen在组织周围画圈可以有效的避免液体流失也能提高操作速度。
5、切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长(大于24小时)原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前将切片脱蜡至修复第二天加抗体进行免疫组化染色如果将装有切片和修复液的容器放在40C冰箱过夜对结果无明显影响如果放在室温特别是炎热的夏天会出现背景着色因此，不可存放时间太长。
6、一抗变质、质量差的多克降抗体注意抗体的有效期过期的抗体要么不昂色要么背暑着色，用新买抗体时更好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较
染不上的原因有哪些?
1、多聚甲醛固定时间过长或者不够调整固定时间
2triton透化triton透化程度不够或者triton透化过度
3、BSA孵育
4、一抗(你确定你加的抗体量是足够的)使用量不够或者稀释比例过大重新调整后再重染
5、二抗(你确定你加的抗体景是足够的)和一抗一样重新稀释或者加大使用量重新染色
6、看荧光荧光强度有可能不足可以重新选择标记物重新标记进行分析
定位不对的原因有哪些?
1、细胞核干扰细胞核位置前面的细胞质染色干扰造成可以降低抗体浓度孵育时间
2、细胞或者组织状态不对细胞或者组织状态不同导致你的目的蛋日细胞定位不同造成最后的定位不
对如果一直出现定位不对问题建议重新培养细胞调整好状态或者重新取材,进行再次染色。
3、共定位问题解析假设想证明某一细胞发生某种变化换句话说就是既有某种蛋白表达又有另一种蛋白表达两种蛋白属于共定位该种情况可以采用免疫双标记检测:如果两种蛋白不属于共定位.假设一种在膜上表达一种在胞浆表达该种情况应该不属于共定位属于共表达这时候实验应该重新设计去验证你的结论。
4、核定位不对核内表达的抗原定位用免疫荧光或者免疫酶标都可以。如果定位不正确,建议封闭和打孔合为一步即在封闭液中添加0.5%TRITON-10037度封闭2小时加一抗后最好4度孵育过夜(16小时)。
