细胞培养技术在生物研究领域内是必不可少的核心环节.在培养过程中面临的一个严重问题就是细胞污染其中支原体是最主要的污染源。支原体在光学显微镜下不可见而且被支原体污染的细胞培养基在一般情况下往往并不浑浊,细胞受损程度也不明显,形态很少改变,因此细胞被支原体污染后很难察觉。细胞一旦被支原体污染后.支原体会消耗细胞培养基中的营养物质.代谢产物不断积累.会导致细胞培养环境中pH值的改变诱导或抑制某些细胞因子的表达.会影响培养细胞的代谢和增殖特征。
在日常工作环境中支原体可以说无处不在.它可以通过人的毛发、口腔、穿着的衣服、动物的皮毛以及日常的细胞培养的操作环境造成对细胞的污染。能够造成细胞污染的支原体种类有很多,有些细胞其至同时感染2种以上的支原体。由干支原体体积很小.直径约在0.2-2.0pm之间.可以通过滤膜而直接造成培养基或血清的污染。从形态结构上支原体形态多变.多吸附在细胞表面或分散于细胞与细胞之间,是一类没有细胞壁的微生物.因此对作用于细胞壁类的抗生素(如青霉素)不敏感常用的检测方法有培养法、荧光染色法、PCR法和电镜观察法。培养法是最为可靠目成本低廉的方法.但培养周期较长.常用于细胞以及临床治疗细胞的支原体检查荧光染色法是用特异荧光染料(Hoechst 33258)染色后在荧光显微镜下进行检测,荧光染料(Hoechst33258)是一种能和DNA特异结合物质.如果检测样品为支原体污染 则附在细胞表面和分散在细胞与细胞之间的支原体DNA着色 在荧光显微镜下可见PCR法检测是通过对支原体特定的序列设计引物 当存在支原体污染时通过PCR特异性扩增.会将目标 DNA特异性的复制,然后通过琼脂糖电泳观检测.会跑出条带出现阳性结果,反之当没有支原体污染时,由于没有模板.PCR无法扩增.则琼脂糖电泳跑不出条带.出现阴性结果:电镜观察法是利用电子显微镜的超级放大功能直接观察培养细胞中支原体污染情况。
在此主要介绍利用荧光染色法来检测培养细胞中的支原体,具体检测步骤如下:
(1)细胞爬片培养:待测细胞培养至传代水平.将细胞消化后接种至含有玻片的细胞板中,培养至60%-70%汇合时.进行检测
(2)漂洗·将细胞板中的培养液吸出 取出玻片用PBS轻轻漂洗
(3)固定:加入适量的固定液.室温放置10min
(4)漂洗:用PBS轻轻漂洗3次
(5)染色:加入适量的荧光染料(Hoechst 33258)工作液,在室温下放置10min
(6)漂洗:用PBS轻轻漂洗3次:
(7)镜下观察:将玻片晾干后.滴加抗荧光猝灭剂,于荧光显微镜下观察、拍照
(8)实验结果如图所示:
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