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将蛋白或蛋白提取液与探针混合孵育，用凝胶电泳的方法分离混合液的各个组分，探针迁移速率大，蛋白-探针复合物因为蛋白质的存在，迁移速率变慢。因此，根据电泳带的位置判断探针是否能和蛋白结合。
经典的EMSA实验使用32P放射性同位素标记探针，但目前常用荧光、地高辛或生物素等非放射性标记。探针的序列根据已有的文献或前期实验的结果确定，注意探针不要有复杂的二级结构和自身互补序列，探针长度一般30-100碱基。
实验步骤：
探针标记
荧光标记在探针合成时加入，地高辛或生物素目前已有商品化的探针标记试剂盒，按照试剂盒进行操作即可。探针标记后纯化。
蛋白样品
EMSA实验的蛋白样品可以是纯化的蛋白，用于确定探针是否可以与确定的蛋白结合；也可以是细胞或细胞核蛋白提取液。
结合反应
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蛋白样品2-5μg，poly d(I-C)1μL，5X结合缓冲液2μL，灭菌超纯水将总体积补至9μL。混匀后，冰浴5分钟。
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加入探针1μL，室温（20-25℃）孵育30分钟。
电泳
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配制6.5%非变性聚丙烯酰胺胶，加样前先在4℃、0.5X TBE中预电泳10-15分钟。
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加样，4℃条件下电泳大约1小时，至指示带接近凝胶底部。
转膜
凝胶、尼龙膜用0.5X TBE浸泡后在4℃条件下转膜。
探针标记
根据探针的标记，按照相应的步骤显色。
典型的EMSA实验结果如下：
实验设计
验证性EMSA
用于验证特定的序列是否可以与蛋白结合，但不能确定与探针结合的蛋白。
竞争性EMSA
在反应体系中同时加入未标记的探针，如果探针与蛋白的结合是特异的，与仅加入标记探针的反应相比，蛋白-探针复合物的信号会降低甚至消失。
超迁移EMSA
超迁移EMSA一般应该在EMSA实验已经成功的基础上进行。
如果蛋白样品不是纯化蛋白而是混合物，验证性和竞争性EMSA都不能鉴定出与探针结合的蛋白。在反应体系中加入特定的蛋白抗体，抗体与蛋白-探针复合物结合，抗体-蛋白-探针复合物的电泳迁移变慢，因此，可以确定探针是否与特定的蛋白结合。
附：蛋白DNA结合缓冲液配方（5X）
TEL:13718279886
