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慢病毒包装技术服务
一、慢病毒背景介绍
慢病毒（Lent virus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展而来的基因载体，该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，达到持久性表达的效果。可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，效果非常理想，具有广阔的应用前景。
慢病毒包装系统由慢病毒表达载体和慢病毒包装载体组成。慢病毒表达载体，即通常所说的穿梭载体，包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒则可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞（293包装细胞），在细胞中进行病毒包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染。
百恩维的慢病毒包装系统是四质粒包装系统。百恩维技术团队已进行过多种目的基因的慢病 毒包装，具有丰富的科研经验。现有客户包括研究所、医院、生物公司等。
二、慢病毒包装技术服务包含内容：
（一）慢病毒载体的构建：
l 将目的基因克隆构建到慢病毒载体，根据不同的研究需求，有用于基因过表达的慢病毒载体、用于RNAi的慢病毒载体、用于启动子活性研究的慢病毒载体等；
（二）慢病毒包装：
- 得到的慢病毒载体，与辅助载体一起转染293T细胞进行包装；
- 将包装好的病毒超速离心收集；
- 将浓缩病毒进行滴定，滴定结果单位为TU/ml。
（三）慢病毒鉴定与质量控制：
- 测序鉴定
- 根据特定引物作RT-PCR鉴定
- 蛋白表达鉴定（根据客户要求）
三、慢病毒的使用
l 表达
本产品感染细胞后，至少要培养24~48小时才能检测目的基因的表达。原因是慢病毒载体的基因组是RNA，需要反转录为DNA，并插入细胞染色体后才能表达。
l 感染细胞最佳MOI的测定
（如293细胞），MOI=1时，80%以上的细胞均表达目的基因。而对于非分裂细胞
，感染效率较低。我们建议通过比较不同MOI （比如0、1、5、10、50、100等），选择适合的MOI进行实验（可以考虑选用携带报告基因的病毒，比如Lenti-EGFP）。
四、慢病毒载体的安全性
原理上，慢病毒安全性依据：
l 删除了全部HIV-1的编码基因，在介导目的基因的表达时，无HIV-1蛋白的表达；
l 对5’和3’ LTR分别进行了删除改造，5’LTR缺失U3，换上RSV enhancer/promoter，使载体的复制不再依赖Tat；3’LTR删除U3，使其不再有启动/增强活性，成为自灭活（self-inactivating, SIN）载体；
l 病毒包装必需的3个蛋白Gag/Pol、Rev、VSV-G（代替HIV-1的Env）分别独立放置在3个质粒上（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），且互相之间没有任何同源序列，大大降低了复制型慢病毒（RCL）的产生几率；
如何避免慢病毒载体潜在的复制型和致癌的风险：
尽管慢病毒载体没有出现过任何意外，但为避免潜在的风险，操作者在实验中谨记如下原则！
所有操作均应尽量在BSL2级生物安全柜中进行，并佩戴一次性口罩和手套，尤其要避免病毒接触口、眼、鼻、耳、伤口等身体开放性区域，避免产生气溶胶，tip头一定要选择带有滤芯的。必须高度注意被污染的尖锐物品，包括针头、注射器、载玻片、移液管、毛细玻璃吸管和解剖刀。每次实验后，立即清理所有接触过病毒的器具，均应高压消毒再进行下一步处理。显微镜台、生物安全柜台面等使用后，用70%乙醇擦拭。意外洒落的含病毒的液体，用卫生纸吸干后，用0.6%次氯酸钠溶液浸泡被污染处1h。装盛慢病毒载体的实验用品，要单独放置，标示清楚。尽量避免意外洒落。对共用实验室的人员进行慢病毒安全培训或提示。
五、慢病毒载体应用
l 用于转染其他病毒难于转染的细胞，比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞
l 构建稳定表达目的蛋白/RNAi的细胞系，再导入动物体内
l 基因治疗
l 制备转基因动物
l 做基因敲除研究
l 药物研究：构建表达受体蛋白的细胞系，研究药物的作用
l 高表达蛋白的细胞系，大规模制备目的蛋白。
