流式细胞术检测细胞凋亡

流式细胞术检测细胞凋亡

细胞早期凋亡检测方法Annexin V
备用试剂
1. 结合缓冲液(10X ): 0.1 M HEPES, pH 7.4; 1.4 M NaCl; 25 mM CaCl2 . 稀释到1X 工作液备用;
2. 碘化丙碇Propidium Iodide (PI).   用PBS稀释到50 μg/ml备用,建议与Annexin V-FITC联合使用;
3. 7-AAD. 推荐与Annexin V-PE或者Annexin V-Biotin 联合使用;
4. 1X PBS  室温储存备用;

染色步骤
1、用预冷的PBS洗涤细胞两次,之后用1X的结合缓冲液重悬细胞, 调节细胞浓度到1X106Cells/ml;
2、取100μl调节好浓度的细胞悬液到5ml流式管底部;
3、加入Annexin V标记蛋白和相应的核酸染料(标记的Annexin V与核酸染料均需要摸索到合适的使用浓度,商品化试剂盒按照说明书操作);
4、均匀混合,室温避光反应15分钟;(若是用Annexin V-Biotin标记蛋白染色,反应后用1X的结合缓冲液洗涤细胞一次,再加入合适浓度的标记链霉亲和素Streptavidin,再加入合适的核酸染料,室温避光反应15分钟)
5、向流式管中加入400μl 1X的结合缓冲液,重悬后及时上流式细胞仪进行分析.

操作注意事项
1、补偿对照管很重要;
2、细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞;
3、细胞浓度与染色用的蛋白量要合适;
4、对不同药物浓度和药物作用时间要进行摸索;

仪器：

实验所用的流式细胞仪为COULTER EPICS XL。

送检样本量：

1）单个细胞：1~2×106 个细胞左右;来源于人、小鼠、大鼠或其它。

2）外周血：EDTA或肝素抗凝全血，5ml左右;来源于人、小鼠、大鼠或其它。

1、 部分常用荧光探针，如PI等，我公司可免费提供，;特殊标记物，如CD抗体等，用户须另行购买，也可委托我公司代购;用户所提供抗体应可与样本发生特异性识别反应。

2、由用户提供的样品或试剂所致的实验问题由用户负责。

附：流式细胞术检测样品推荐制备方法：

细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品（PI染色）的制备：

（1）待测样本制成单细胞悬液，然后200g离心5分钟，弃上清。

（2）用4℃预冷的70%冷乙醇固定，4℃保存，至少固定18小时。

（3）调整细胞浓度为106细胞/毫升，取1毫升细胞悬液，用PBS洗三次，细胞重悬于1毫升PI染液中，37℃孵育30分钟即可进行流式分析。

（4）PI染液终浓度为50微克/毫升，RNase A终浓度为20微克/毫升。