Western Blotting实验技术服务

Western Blotting实验技术对外服务（传统方法）

简介：免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的

免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成

为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。

主要实验步骤如下： 

1. 蛋白质抽提       2. 蛋白质定量             3. 变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)  

4. 蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜          5. 膜的封闭和抗体孵育          6. 结果检测

7. 数据分析                                                            8. 提供实验报告

仪器与试剂：

1．仪器

高速组织捣碎机：SWISS KINEMATIC Ltd. Co（型号：PT1600E）

电泳仪：北京六一仪器厂（型号：DYY-8C）

电泳槽：北京六一仪器厂（型号：DYCZ-24D）    

转印槽：北京六一仪器厂（型号：DYCZ-40D）

低温高速离心机：湖南湘仪公司（型号：H2050R）

超低温冰箱：美国FORMA公司（型号：702）

分光光度计：上海分析仪器总厂（型号：721）

脱色摇床：上海琪特分析仪器有限公司（型号：STS-2）

操作流程：

1样品准备

1）分别取大约200mg组织加入液氮碾磨成粉末状，按每200mg组织加900μl上样Buffer(无溴酚蓝)和100ul 10mg/ml PMSF，混匀，玻璃匀浆器冰点匀浆

2）4℃，12000rpm离心10min

3）取上清夜-70℃冻存24hr

5）4℃12000rpm再次离心10min，取上清分装，一份用于定蛋白，另一份加入溴酚蓝(0.1%(W/V))后于100℃加热4min，后于-20℃保存待用。

2定蛋白及计算电泳上样量

根据总蛋白测定试剂盒说明书操作测定样本中的总蛋白含量，电泳上样量定为40ug

3电泳

1）安装好电泳装置

2）根据不同的指标配制相应浓度的分离胶，灌胶约3/5体积，液封(<10%用0.1%SDS,>10%用异丙醇)

3）30min后，待凝后倾去封液

4）配5%的浓缩胶，灌胶至距平板顶部2mm处，插入梳子, 30min后，待凝后拔出梳子，用去离子水清洗加样孔，用滤纸吸干

5）上样：各样品取50ug上样，marker取10μl上样(上样前需按说明书进行预处理)

6）缓慢加入内、外槽缓冲液，接通电源，90v电泳至指示剂进入分离胶后，调电压至150V继续电泳

7）当指示剂距平板底端1cm处时停止电泳

4 转膜及检测

1）准备2个Φ12cm的平面皿，一个装去离子水浸泡NC膜20min，另一装转移缓冲液浸泡海绵和滤纸20min

2）取下胶，切除浓缩胶部分后，将分离胶浸入转移缓冲液中约5min

3）按顺序安装好转膜装置（黑色板-海绵-三层滤纸-凝胶-硝酸纤维膜-三层滤纸-海绵-红色板）

4）完全排除气泡，4℃，100mA转膜2hr。

5）倾去转膜缓冲液，拆除转膜装置，将硝酸纤维膜放入丽春红中摇床染色15min，用去离子水清洗至能看到条带，后用铅笔标出marker位置，再用去离子水震荡以去除浮色。在右上角剪去一角以辨上下左右

6）将膜转移至另一容器中，用5%脱脂奶粉封闭, 4℃过夜

7）将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的一抗

8）37℃摇床孵育约2hr

9）PBST洗涤4次，每次5min

10）将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的二抗，37℃摇床孵育约30min

11）PBST洗涤4次，每次5min

12）将膜转移至尽可能小的容器中并加入BCIP/NBT底物，室温孵育30min

13）取出NC膜，用蒸馏水漂洗后晾干

14）扫描及分析

服务要求：

· 样本要求：组织样品，每份样本约250-500mg,新鲜或正确保存的组织。细胞样本：每份样本：1*10 6－1*10 7细胞数。 

· 客户提供有效的一抗，（国产抗体一般不接纳） 一抗自备或代购。 

· 客户提供欲检测目的蛋白的详细背景资料。以及提供样本的种属，类型。 

结果提供：

· 目的蛋白实验图片。 

· 灰度分析结果。（免费分析） 

· 内参结果。（免费跑胶） 

· 详细的实验步骤。 

· 免费提供蛋白样本保存液。 

完成时间：

接受样本后，1月以内。

注意事项：

1、客户要确保模型建造的成功性。

2、客户要确保抗体的有效性。

3、如要加快的客户可以和我们联系沟通。

4、收费标准：以每张膜8个样本收费，不足8个样本的按8个样本收费）