操作步骤如下
1、出生 2 d SD大鼠经戊巴比妥钠麻醉后,碘酒、75%乙醇消毒腹部皮肤,依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜,无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks平衡盐液中。
2、在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层,除去脑膜,剪碎组织成约1mm3大小,加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱内消化20min,中间摇晃一次。
3、随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液(DMEM+10%FBS)的离心管内终止消化液作用5min。
4、用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM+10%FBS的离心管内,用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次,静置后取上清吸到另一支离心管内。重复上述步骤2~3次。
5、将所收集的上清经200目筛网过滤。
6、过滤后的细胞悬液于800r/min离心5min,弃上清,管内加入新鲜培养液(DMEM+20%FBS)并吹打成单细胞悬液。
7、细胞计数,调整细胞密度按1.5×105/cm2种入6孔板内,放入CO2孵箱中培养。培养48h后换液并加入Ara-C使其终浓度为1×10-5mM/L。Ara-C作用24h后全量换液。以后每隔3天半量换液一次。
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