用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA,可以得到大量的基因组DNA片段,然后将这些DNA片段与载体连接,再转化到细菌中去,让宿主菌长成克隆。这样,一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段,整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库。基因文库=基因组文库+cDNA文库 。
载体的种类和特征
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受体细胞 |
结构 |
插入片段 |
举例 |
质粒 |
E.coli |
环状 |
很小,<8kb |
pUC18/19 ,T-载体, |
λ噬菌体 |
E.coli |
线状 |
9-24kb |
EMBL,λgt系列 |
丝状噬菌体及噬菌粒 |
E.coli |
环状 |
<10kb |
M13系列 |
粘粒载体 |
E.coli |
环状 |
35-45kb |
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BAC |
E.coli |
环状 |
约300kb |
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PAC |
E.coli |
环状 |
100-800kb |
PCYPAC |
YAC |
酵母细胞 |
线性染色体 |
100-2000kb |
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MAC |
哺乳动物细胞 |
环状 |
>1000kb |
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病毒载体 |
动物细胞 |
环状 |
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SV40 载体,昆虫杆状病毒载体 |
穿梭载体 |
动物细胞和细菌 |
环状 |
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pSVK3质粒,PBV,Ti质粒, |
基因组文库构建步骤
1、载体: 噬菌体:48.5kb,插入型(最多可容纳9kb)、取代型(可容纳 38-51kb,最适19-20kb), EMBL, Charon 粘性质粒(Cosmid):4-6kb, 质粒+噬菌体的性质,可容纳大片段的外源基因,最多可容纳46kb。 酵母人工染色体克隆体系(YAC,Yeast Artificial Chromosome Cloning System) 插入大小200—1000kb
2、 载体DNA的制备: 高分子量的外源DNA 100-150kb载体DNA酶切反应-----载体臂的纯化-----载体脱磷处理 (常用BamHI) (蔗糖密度梯度离心) (碱性磷酸酶)
3、连接和包装:外源片段与两臂之间的比例,包装蛋白
4、感染宿主菌:选择合适的宿主菌,LE392, NM538, NM539, KW251等
5、基因组文库的保存和扩增:
6、测滴度,要在106fu以上
7、保存:氯仿4℃,7% DMSO -70℃
您需要提供
动物的血或细胞、新鲜植物叶片、活体昆虫或纯化好的DNA样品。
我们提供
1、文库(10%甘油菌)以及菌落效价(CFU/ml);
2、随机抽样测序结果。
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