cDNA文库构建/EST测序分析

• 通过构建cDNA表达文库，
• 可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针；
• 可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究

而cDNA文库具有组织细胞特异性，使得它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，因此成为了研究工作中最常使用到的基因文库。

我们的特点：

△采用Clontech公司SMART技术，高效构建普通cDNA文库

△有效去除rRNA、tRNA，提高文库中有效信息量；

△特有的全长cDNA文库构建方法，全长率最高可达90%；

△严格的质量控制，确保客户得到满意的cDNA文库；

△无缝连接3730XL测序平台，为您的实验提供整套的解决方案；

EST测序

对构建好的文库进行测序，Phred-20质量标准，平均有效读长超过600bp！

您还以获得

信息分析服务：

▲ORF预测

▲基因注释

▲功能聚类

实验方案

第一阶段

1）以客户提供的组织材料提取总RNA，分离mRNA，纯化总mRNA后，进行反转录合成cDNA第一链。

2） 通过引物延伸或LD-PCR法进行dscDNA合成，经sfiI酶切后，经层析柱分离cDNA（回收大于500bp的cDNA）。

3） 将分级纯化的dscDNA与sfiI酶切的逆转录病毒载体pRetro-Lib（Amp抗性）连接。

4） 将重组产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞 客户能提供保质保量的组织（5g）或者细胞株（2×107细胞）

向客户提供的结果及材料：

1、高质量的起始RNA变性电泳图

2、 dscDNA电泳图（含marker标注）和 pRetro-Lib的sfiI酶切图

3、转化大肠杆菌生长的重组克隆（即原始库）培养皿照片（若干张）

4、 详细的研究结果和分析

第二阶段

甘油保存大肠杆菌文库

初级cDNA文库的QC

1) 不同稀释度测定平均滴度，检测库容量（重组子克隆数目）。

2)随机挑取40个克隆子，PCR方法或sfiI酶切检测重组克隆子比例（重组率），检测平均插入片段大小。

3) 每个文库随机挑取20个克隆子抽提质粒进行双向测序，通过序列分析判断插入片段是否含有全长ORF。 文库验收标准 ：

库容量： >1×10 7 cfu/ml

平均插入片段： >1.2 kb

重组率：>95%

全长基因比例：>65%

向客户提供的结果及材料：

1、不同稀释度生长的重组克隆培养皿照片（若干张）和平均滴度计算过程

2、构建好的初始cDNA文库的菌液（含甘油）5ml，分装0.5ml/进口冻存管（冻存-80℃）

3、40个克隆子的PCR鉴定电泳图（含marker标注）和40个克隆子插入片段长度数据（表格）

4、20个随机克隆子的双向测序报告纸制版（含测序引物序列和所在载体位置）和分析

5、文库的评价，包括库容量、插入片段平均长度、重组效率、 cDNA 完整性评价。

第三阶段  文库扩增

按Creator™ SMART™ cDNA Library Construction Kit进行文库扩增，并测定滴度。

文库验收标准 ：

库容量： >1×10 8 cfu/ml

向客户提供的结果及材料：

1、扩增所需的培养皿数量计算过程和重组克隆培养皿照片（若干张）

2、20ml扩增文库的菌液（含甘油），分装1ml/进口冻存管（冻存-80℃）。