流式补偿怎么调？何时必须做 FMO 对照？

一、先明确补偿的本质

流式补偿解决的是荧光溢漏（spillover）：一个荧光素在检测通道之外的其他通道里被检测到的信号。补偿不是“调增益”，而是通过单染样本计算溢漏系数，在软件里做线性扣除。补偿调不准，最常见的原因不是算法问题，而是单染管设置不当或电压不合适。

二、补偿的规范操作步骤

1. 先定电压，再做补偿。所有通道的 PMT 电压应在实验前确定并保持固定，补偿矩阵只在固定电压下有效。电压改变后必须重新做单染。
2. 单染管要“够亮、够纯”。每个荧光素单独染一份细胞（或补偿微球），阳性群应明显分离、MFI 足够高，通常阳性群与阴性群的中位荧光强度比在 10 倍以上较理想，具体以仪器和预实验为准。阳性群太弱会导致溢漏系数拟合不准。
3. 用同一群细胞、同一电压。单染管与实验管应使用相同样本类型和相同电压设置；若用补偿微球，需确认其光谱与所用荧光素匹配。
4. 逐对检查溢漏。在双参数图上观察单染管在非目标通道中的信号，软件自动计算补偿矩阵后，回到实验管检查双阳性群是否落在预期位置。若仍有拖尾，可微调补偿值，但幅度不宜过大，通常以 1%～5% 量级微调，具体以软件显示为准。
5. 多色 panel 注意串联染料。如 PerCP-Cy5.5、PE-Cy7 等串联染料可能发生解离，导致补偿关系随样本状态变化，建议新鲜染色、避光、尽快上机。

三、什么时候必须做 FMO 对照

FMO（fluorescence minus one）对照是除目标荧光外包含 panel 中其余所有荧光的样本，用于界定该通道的“本底上界”，从而设定阳性门。以下情形建议必须做：

• 目标抗原表达弱或连续表达（如细胞因子、磷酸化蛋白、转录因子），阴阳性群之间没有明显分界；
• 多色 panel 中通道间溢漏较大，目标通道受邻近通道影响明显；
• 需要精确判定“阳性比例”而非仅看趋势；
• 自发荧光较高的样本（如某些髓系细胞、组织消化后的细胞）。

若目标抗原表达强、阴阳性群分界清晰，且补偿已充分验证，可不必每个通道都做 FMO，但仍建议至少对弱表达通道设置 FMO。判断标准是：以 FMO 中 99% 以上细胞所在的荧光范围上界作为阳性门下限，而不是凭阴性对照管随意画门。

四、预防建议

• 实验前用单染管验证 panel 中每一对通道的溢漏程度，溢漏过大的荧光组合应考虑换通道或换荧光素；
• 固定电压和补偿设置后记录在案，后续实验沿用；
• 每批新样本、新批次抗体建议重新验证补偿；
• 涉及固定、破膜等处理时，注意处理可能改变细胞自发荧光和染料光谱，需重新评估补偿；
• 所有染色、上机操作按实验室生物安全与危化品管理规定执行，含叠氮钠的缓冲液和荧光染料废液按规定收集处理。