案例2：慢病毒介导RNAi干扰联合化学疗法在肺癌治疗中的研究 
        

凋亡抑制蛋白xx在肺癌中的表达及其功能的研究

1. 靶向xx基因的RNA干扰对肺癌生物学功能影响的研究     1.1 构建针对XX基因的进行RNA干扰的病毒载体

   1.2 将该病毒载体转染入高表达xx基因的肺癌细胞株。
实验分组为：未转染组，阴性对照组，阳性对照组（实验组）。
转染后采用免疫荧光，实时定量PCR，Western blot检测xx指标的表达变化情况，计算其抑制效率。

1.3 检测干扰前后Caspase-3, Caspase-9酶的活性情况  

1.4 生物学功能检测。

 (1) MTT检测细胞增殖情况

 (2) 流式细胞仪检测细胞周期

 (3) 流式细胞仪检测细胞凋亡

 (4) TUNEL检测细胞凋亡

 (5）电镜观察细胞凋亡

 (6) 平板克隆实验检测细胞增殖

 (7) 检测细胞侵袭转移情况

 2. 干扰后肺癌细胞生物学功能的检测：

 3. RNA干扰联合化疗药（自选）对肺癌生物学功能影响的研究:    3.1 构建病毒载体同上。

3.2 转染分组为：未转染组，阴性对照组，化疗药组，化疗药联合RNA干扰组

3.3 生物学功能检测。

 (1) MTT检测细胞增殖情况

 (2) 流式细胞仪检测细胞周期

 (3) 流式细胞仪检测细胞凋亡

 (4) TUNEL检测细胞凋亡

 (5）电镜观察细胞凋亡

 (6) 平板克隆实验检测细胞增殖

 (7) 检测细胞侵袭转移情况

 4．动物实验

 RNA干扰动物实验

   (1)将肺癌细胞注射到裸鼠（4-6周龄）皮下，同时将培养稳定生长的干扰的细胞株也注射入裸鼠上，或者当肿瘤长大后将干扰病毒直接注入裸鼠肿瘤中，裸鼠分组为：正常细胞组，阴性对照组（注射生理盐水或其他阴性对照），RNA干扰组。处理后观察后裸鼠肿瘤的生长情况。

   (2)处理后观察半个月到一个月，然后将裸鼠处死，取下肿瘤标本，免疫组化，实时定量PCR，Western blot方法中 的检测目的基因的表达变化。
(3)对取下的肿瘤标本采用TUNEL检测细胞凋亡，电镜观察细胞凋亡。

 5．蛋白组学和质谱分析。

将RNA干扰前后的目的细胞进行蛋白组学研究，寻找差异蛋白。找到的差异蛋白进行质谱分析后用WB来鉴定。