自1992年首次描述以来，数字PCR（dPCR）已实现核酸绝对定量超过三十年。作为传统PCR和实时定量PCR的继任者，dPCR将样本分割成数千个微反应，相比传统方法提供更高的精度、灵敏度、重现性和抑制剂耐受性，且无需标准曲线。因此，该技术拥有众多应用，包括突变和变异检测、基因表达分析、病毒载体定量以及环境DNA（eDNA）和RNA（eRNA）检测。本文探讨dPCR如何改变后一研究领域：从检测入侵蛇类和鱼类到描绘淡水生物多样性，该技术已转变我们研究周围世界的方式。
用dPCR检测入侵鱼类eDNA
一种基于dPCR的新型检测方法，利用水中遗留的DNA痕迹检测入侵物种，可能有助于阻止两种淡水鱼带来的生态威胁。该平台由佛罗里达大学（University of Florida，FL，USA）的研究人员开发，提供快速、经济且可靠的预警工具，以早期发现入侵者并评估清除效果，有望成为野生动物保护的福音。
入侵物种对佛罗里达的多种生态系统构成重大威胁，包括淡水栖息地，非本地鱼类正在那里造成严重破坏。两种物种尤其令人担忧：bullseye snakehead（Channa marulius）和Asian swamp eel（Monopterus albus）。这些肉食性、呼吸空气的入侵者原产于亚洲，但已在佛罗里达扩散近30年，捕食并竞争本地物种。
检测和清除此类入侵者的努力已大大受益于eDNA分析和宏条形码等技术。然而，在监测特定或多个物种时，这些方法效果不佳，而dPCR及其显著更高的灵敏度则表现出色。研究人员因此开发、优化并验证了一种双重dPCR检测方法，可使用单次水样中的eDNA同时检测Asian swamp eel和bullseye snakehead。他们设计该检测方法针对细胞色素c氧化酶亚基I（COI）条形码区域，该区域在物种间高度变异，允许开发物种特异性检测。
在受控条件下，系统能在将bullseye snakehead引入水中仅5分钟后检测到高水平的eDNA。同时，野外eDNA样本表明，该检测能准确识别两种物种，同时避免交叉检测其他常见鱼类和野生动物。研究结果突显了多重dPCR检测在清除两种重要入侵鱼类方面的潜力，并展示了其在eDNA样本中识别目标生物体的实用性。
“通过数字PCR进行eDNA分析是入侵物种监测的一种极其强大的方法，因为其高效的工作流程和高灵敏度允许检测水样中的单个细胞，”资深作者Brian Bahder在一份声明中总结道。
dPCR助力淡水生物多样性快照
利用dPCR识别淡水系统中的环境核酸，麦吉尔大学（McGill University，Montreal，Canada）的研究人员实时观察了eDNA和eRNA水平随时间的变化。通过这样做，他们强调了一种强大的潜在工具，用于非侵入性生物多样性监测。
我们已经看到eDNA在追踪淡水物种方面的有用性，但要充分发挥其潜力，需要了解其在互联生态系统中的降解和可检测性——eRNA也是如此。先前的研究表明，基于eDNA的标记在水生环境中具有不同的衰减率，这意味着选择正确的标记对于成功的生态调查至关重要。然而，我们对基于eRNA的标记及其变异如何影响物种检测的了解要有限得多。
为了填补这一空白，团队设计了一种检测方法，结合时间序列采样和dPCR，研究淡水中型生态系统（模拟自然生态系统的水箱）中水蚤（Daphnia pulex）的eDNA和eRNA。他们针对四个分子标记（16S、18S、COI和乳酸脱氢酶A），比较了基因组起源（线粒体 vs 核）和转录类型（mRNA vs rRNA）的衰减率和可检测性。使用dPCR，研究人员能够精确量化eDNA和eRNA下降的速度，捕捉所有不同标记的精细时间模式，这在早期研究中很少做到。
他们发现，在所有标记中，eRNA的降解速度显著快于eDNA，且mRNA的降解速度快于rRNA。尽管如此，在水稀释10,000倍后，eDNA和eRNA在中型生态系统中仍可检测到。“这表明，即使RNA分解迅速，像数字PCR这样的灵敏工具仍能检测到它，展示了其在追踪淡水系统中活跃生命方面的潜力，”研究作者Wendy Morgado Gamero和Orianne Tournayre在The Conversation中写道。
用dPCR eDNA工具追踪海带衍生碳
根据Bigelow Laboratory（ME，USA）领导的研究，使用dPCR的eDNA工具可帮助准确量化海洋沉积物中的海带衍生生物量，可能有助于未来的碳封存努力。海带水产养殖是一个快速增长的行业，在更公平的‘蓝色经济’中扮演重要角色。商业农场生产富含碳的原材料，这些材料在海底沉积物中积累，因此可用于溶解碳捕获形式的生物修复。要充分理解海带在这方面的价值，需要精确测量随时间积累在沉积物中的海带衍生碳量。
追踪此类生物量的传统方法通常涉及一系列 bulk nutrients 和稳定同位素，并在灵敏度、特异性和成本之间面临权衡，使其不适合大规模实施。这一限制为利用eDNA定量的工具打开了大门。研究人员测试了其中两种技术——宏条形码和dPCR，检查了缅因湾一个商业海带农场下方沉积物，该农场种植糖海带（Saccharina latissima），持续两个养殖季节，希望检查整体细菌、古菌和真核生物多样性。同时，使用同位素比质谱分析沉积物碳和氮含量。
他们发现，宏条形码不够灵敏，无法检测到许多海带eDNA。然而，他们设计的针对COI线粒体基因的S. latissima特异性dPCR检测表现要好得多。比较农场下方和附近地点的沉积物，dPCR数据揭示了细微但显著的差异：直接位于农场下方的样本中海带COI基因拷贝数略高。最高COI拷贝数来自观察到海带生物量积累的地点。
“宏条形码方法对于剖析整个群落的细微差异很有价值，但这种物种特异性工具在检测海带方面被证明极其灵敏且相当成本效益，”资深作者David Emerson在一份声明中总结道。尽管工作表明，总体而言，海带水产养殖对农场下方沉积物影响很小，但团队仍乐观认为这些工具可帮助引领我们走向更好的蓝色经济。“回到我们关于碳封存的 overarching 问题，我们开始思考如何实际帮助农民改进——并利用——这一过程，确保更多海带被战略性地沉积并持续更长时间，”Emerson补充道。“这是一个以前几乎无法回答的问题，但随着我们开发的这些新型eDNA方法，变得越来越简单。”
dPCR为入侵蛇类根除带来‘一线’希望
现在，让我们回到佛罗里达和入侵鱼类检测背后的团队，他们还开发了一种四重dPCR检测方法，用于检测非本地蛇类的DNA。该工具允许他们同时定位四种物种曾经出现的位置，即使它们已经离开该区域数周，这应有助于根除工作，佛罗里达大学的研究人员希望如此。随着爬行动物在佛罗里达继续扩大其范围，对新和改进的检测和监测方法的需求日益增长。主要关注点是蟒蛇类，它们是非常成功的入侵者，对本地野生动物以及大沼泽地恢复努力构成重大威胁。正如预期，这些蛇已被证明是科学家的棘手目标。传统调查方法依赖于视觉检测，但……
来源：BioTechniques（英文原文，生物航编译，内容以原文为准）