欧洲分子生物学实验室（European Molecular Biology Laboratory，EMBL；德国海德堡）的研究人员首次利用人核仁的三维图像，在细胞内可视化核糖体的组装路径。相关成果由Christoph Müller、Sara Cuylen-Häring和Julia Mahamid三个研究组合作完成。

核糖体是细胞合成蛋白质所依赖的复杂分子机器，其组装过程十分精细。以往大量关于核糖体构建机制的认识来自离体（ex situ）研究，即在脱离原生细胞环境的条件下解析结构，而对细胞内原位（in situ）组装过程的理解一直有限。

两种成像技术的组合

研究团队将冷冻电子断层扫描（cryo-electron tomography，cryo-ET）与冷冻光电关联显微技术（correlative light and electron microscopy，CLEM）结合，对核糖体组装发生的场所——细胞核内的核仁——进行高分辨率成像，首次在完整人细胞中观察到核糖体组装通路。研究获得了组装通路上数十个中间体的亚纳米分辨率细胞内结构，补充并拓展了此前基于离体结构得到的认识。

传统结构生物学方法需要把核糖体组分从细胞中取出，某些仅短暂结合的组分在分离过程中会解离。而在细胞内成像的难点在于核仁本身：它是细胞核内极为致密、低对比度的区域，用cryo-ET观察在技术上颇具挑战。

为此，研究人员用cryo-CLEM为冷冻电镜“导航”。第一作者、Müller组的博士前研究员Xiaohan Zhao表示，这种组合方法帮助团队确定了组装过程实际发生的位置，cryo-ET使他们不必把前核糖体（pre-ribosome）从细胞中分离，而是直接在核仁内观察。

完整人细胞对电镜来说过厚，需先快速冷冻并切成薄片，再在显微镜下成像，所得图像称为断层图（tomogram），多张断层图叠加后可重建亚细胞区域的3D图像。为在庞大的细胞中找到微小的核仁，团队标记目标核仁组分，用荧光显微镜定位。Christoph Müller形容，电镜下一切基本呈灰色，而CLEM让被标记的组分“亮起来”，从而锁定核仁并采集该位点的高分辨率断层图。

两种显微技术联用需要在这两种模式下都可见的细胞内参照物，脂滴成为理想选择。Zhao介绍，薄片中脂滴数量太少，她与同事交流后想到向细胞添加少量油酸，诱导产生足够脂滴用于图像配准。

组装路径的新发现

基于300多张断层图构建的细胞内关联cryo-ET图谱，团队在完整细胞中不仅证实了此前离体研究识别的人核糖体亚基组装机制，还发现了额外的关键互作伙伴。他们分别以8.2 Å和6.9 Å的分辨率重建了两个关键核糖体亚基前体——SSU processome和pre-60S。Zhao表示，这虽未达到原子分辨率，但已足以揭示蛋白质和RNA的二级结构元件。

团队还通过抑制RNA聚合酶I（合成核糖体RNA的分子机器）研究了组装通路的调控。抑制后一小时内，组装颗粒的组成明显改变，一个亚基前体从核仁中消失。Zhao推测，原因可能是一个亚基迅速输出，另一个则被困在内部；两个亚基动力学不同，小亚基组装较快、不到一小时，大亚基耗时更长，这可能指向不同的调控机制。

研究还检验了关于核仁内核糖体组装的一个长期假设，即每个结构都可对应到其在细胞中的位置、核糖体从核仁中心向边缘移动时逐步成熟。Müller表示，仔细观察后发现成熟度并不能清晰地对应位置，一种可能的解释是存在多个中心，不同位点的梯度相互重叠混合。

方法与局限

Müller指出，最早的组装中间体仍然太小而无法解析，尺寸仍是细胞内cryo-ET的普遍限制。随着数据积累，这些“快照”有望讲述核仁内更动态的过程。Zhao表示，未来还可研究颗粒如何被运出核仁和细胞核，同样的方法或可用于研究细胞核内其他大型复合物。

团队认为该方法的意义不限于前核糖体。Müller总结说，这一方法将越来越重要，因为它可以精准靶向某个细胞事件、理解核糖体组装这类复杂过程，并获得能揭示全过程的高清图像。该研究提示，核糖体并非在固定流水线上装配，而是在一个活跃、拥挤的空间中完成组装，位置与细胞状态共同影响组装进程。

来源：BioTechniques（英文原文，生物航编译，内容以原文为准）