近日，美国湖 Superior 州立大学（Lake Superior State University）生物学教授 Britton Ranson Olson 领衔的研究团队在 BioTechniques 发表论文，报道了一种经过优化的 qPCR 双重复用（duplexing）方法，用于鲟鱼（Acipenser 属）的分子性别鉴定。该研究的第一作者 Britton Ranson Olson 长期致力于低含量、痕量 DNA 检测分子方法的开发，此前已设计过环境 DNA 检测 assay，此次则将目光投向鲟鱼的性别判定。

原有方法的短板

据作者介绍，鲟鱼性别鉴定此前已有分子方法，但长期受制于缺乏雄性特异性标记。她在梳理相关文献时发现，现有方法在检测雄性样本时没有设置任何对照环节，这一缺陷正是她希望解决的问题。新工作的核心，是在原有方法基础上进一步提升效率，并为雄性鱼的检测补上对照这一环。

内参对照让阴性结果“有意义”

从实验设计角度看，新增的对照有助于研究者区分两种情形：一是确证的阴性结果，二是检测或样本本身不合格。作者表示，用这种简洁的思路设计类似的检测 assay，可以让阴性结果真正具备解释力——加对照之后，研究者能够分辨某条鱼是检测为阴性，还是这次检测根本没有给出明确答案。她强调，这种验证对于对结果建立信心至关重要。

该方法的潜在应用并不局限于分子性别鉴定。Ranson Olson 坦言自己并非鱼类方向的研究者，她认可该 assay 对鲟鱼研究群体的价值，但更看重其可广泛用于病原体检测，尤其是样本量少或样本质量存疑的场景。研究者可借助该方法清晰区分阴性结果与未给出明确答案的检测，也就是应被判定为无效的结果。她表示，这是最令她兴奋的部分。

方法已在数百份样本中应用

关于使用建议，作者称除论文中详述的内容外并无特别提示，认为该方法本身较为直观且通用性强。该方法在湖 Superior 州立大学淡水研究与教育中心（Center for Freshwater Research and Education）开发完成，该中心已用新 assay 检测了数百份鲟鱼样本，并将持续开展相关工作。随着这一项目收尾，Ranson Olson 目前正专注于优化针对入侵藻类 Didymosphenia geminata 的 DNA 检测 assay，并希望进一步完善该技术，以便在极低含量水平下检出该生物的存在。

来源：BioTechniques（英文原文，生物航编译，内容以原文为准）