活体观察大脑深部神经元活动，长期受制于组织散射和背景荧光。洛克菲勒大学（The Rockefeller University）的研究团队重新设计了一套三光子显微成像平台，在不手术切除上层皮层的情况下，记录了活体小鼠深部脑区的神经元活动。相关研究由该校神经技术与生物物理实验室主任Alipasha Vaziri博士领导，成果发表于《Nature Methods》。

TrUDI平台：从激光到光学的系统优化

这套平台被命名为三光子超深成像（Three-photon Ultra-Deep Imaging，TrUDI）。研究团队借助计算机模型，对激发激光、光学系统与采集参数进行协同调整。论文指出，TrUDI使激光、光学系统与采集参数同时匹配安全激光暴露下的线性与非线性极限，并满足单细胞分辨率钙（Ca2+）成像的时空要求。

与以往方法相比，TrUDI在相同激光功率下产生的可探测荧光光子数约为原来的250倍，从而在约2毫米深度实现单细胞分辨率的神经元群体活动记录。此前三光子功能成像的深度约为1.2毫米，尚未达到该技术超过2毫米的理论深度极限。

按需激发降低组织热损伤风险

光在脑组织中传播时会发生散射，使荧光信号与背景越来越难以区分。三光子显微成像产生的背景荧光低于双光子显微成像，有望实现更深成像，但获取足够信号需要高能量激光脉冲，提高平均激光功率又会带来组织加热和损伤风险。

为此，团队还开发了一种神经元靶向激发方案，仅在激光扫描到已识别细胞时才开启激发。Vaziri表示，这一做法来自一系列系统、有原则且从底层出发的优化。上述改进共同提高了可用于记录单个神经元瞬态活动的荧光信号。

成像视野与深度表现

平台在小鼠中进行了测试。论文报告称，在约230×230微米2的视野内以8.6 Hz的帧率记录，成像深度达到小鼠皮层和海马约2毫米。这一进展使此前需要去除上层组织才能进行光学成像的神经环路变得可及，有望帮助研究人员考察深部脑区神经元群体如何协调活动。

不过，该技术并不能让所有深部结构都变得可及。Vaziri指出，纹状体（striatum）中仍有区域无法成像，还有一些位置更深的脑核团仍需侵入性方法。目前，这项工作展示了协同优化如何让三光子成像更接近其基础深度极限，同时保留被研究区域上方的组织。

来源：GEN（英文原文，生物航编译，内容以原文为准）