近日，来自北卡罗来纳大学教堂山分校（UNC Chapel Hill）细胞生物学与生理学系的研究人员Hawon Yoon和Aashita Rajput等人在BioTechniques上发表了一种新的免疫荧光染色方案，该方案针对振动切片机（vibratome）制备的多细胞厚自由漂浮切片，结合了热介导的抗原修复（antigen retrieval），能够在保持组织三维完整性的同时，暴露被掩蔽的抗原。

方法亮点

该方案提供了两种热介导抗原修复方法：使用烤箱或压力锅，具体取决于目标抗原。研究人员在小鼠肝脏中验证了该方法，通过可视化肝小叶边界以及关键细胞标记物Hnf4a、ERG和Ki67，展示了其在未损伤和再生肝脏中的应用。与现有方法相比，新方法具有更好的信噪比、在大面积组织切片上染色一致，并能更深入地渗透到厚组织切片中。

“我们实验室的研究聚焦于血管在肝脏健康和再生中的作用。我们研究肝小叶这一功能单元内的肝血管。在工作中，我们注意到缺乏能够对三维肝小叶进行可视化和定量评估的技术。”研究人员在采访中表示，“为了有效研究肝小叶及其血管，我们需要能够观察深度超过5-10微米的大块组织，这通常需要石蜡或冷冻包埋组织。这促使我们优化了利用100微米厚自由漂浮切片的新型免疫染色方案，以帮助可视化肝小叶的结构和不同细胞类型或状态。我们希望该方法易于推广，因此使用了低成本且易获取的材料和设备。”

对实验室研究的影响

研究人员希望该方法能扩展组织学分析中可用的细胞标记物目录。“三维整体分析正变得越来越重要，该方法展示了在组织切片深处对难以接近的抗原进行免疫标记的强大能力，将为研究人员提供更大的灵活性，以整体方式探索器官的三维环境。”他们表示，“我们期望这将增强研究人员剖析器官健康、再生和疾病（尤其是肝脏和其他高度复杂或密集的器官）背后细胞机制的能力。”

最佳实践建议

对于希望使用该方法的研究人员，他们建议：“我们发现，组织经过热介导抗原修复后需要格外小心处理，因为切片可能变脆并容易撕裂。我们使用细尖画笔，轻轻移动切片。此外，为确保最佳结果，我们鼓励研究人员在尝试新抗体时测试不同的抗原修复缓冲液和加热或压力条件，并进一步实验减少背景的方法，如淬灭（quenching）。”

关于下一步研究，他们表示正在利用该方法理解肝脏再生的机制，以及是什么阻碍了慢性损伤肝脏的完全再生。

来源：BioTechniques（英文原文，生物航编译，内容以原文为准）