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原位末端凋亡法（Tunel）实验技术
简介：
TUNEL 技术, 即脱氧核苷酸末端转移酶( Term inal2deoxynucleo t idyl t ran sferase, TdT )介导的x2dU TP 缺口末端标记(TdT 2m ediatedx2dU TP n ick end labeling, TUN EL ) 技术, 是目前原位检测细胞凋亡最敏感、快速、特异的新方法, 已广泛用于生物、医学研究领域。
TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL)是一种用来检测细胞凋亡(apoptosis)的分析方法.细胞凋亡有一项重要的特征为细胞内的DNA会碎裂成片段(DNA fragmentation),TUNEL可以有效的去探测DNA片段的产生,所以可以传达细胞凋亡的讯息.TdT为terminal deoxynucleotidyl transferase,此种酵素可以在没有DNA模板的情形下,连结核甘酸到DNA的3'-OH处.1992年,以色列科学家Gavrieli等人将TdT引为为标定DNA片段的一个酵素,自此衍生出TUNEL此项技术.TUNEL的好处是可以在细胞凋亡发生的早期,即可侦测到DNA片段的产生,并且可以直接使用在组织切片上,观察细胞凋亡发生的位置.所以TUNEL目前为广泛接受与使用的一种细胞凋亡的分析方法.
[试剂]
1．TUNEL试剂盒：购自罗氏公司
2．DAB：Sigma
3．PBS和TBS缓冲液：国药集团
[仪器]
切片机：德国Leica，RM2145型
展片机：德国Leica，HI1210型
烤片机：德国Leica，HI1220型
[操作流程]
- 石蜡切片，常规脱蜡至水; 石蜡切片4um贴在涂有切片粘合剂的载玻片上，58。C烤24h，常规脱蜡至水，二甲苯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 各10分钟，无水乙醇，95%，85%，75%乙醇，各2分钟，水洗2分钟。
- 0.3%H2O2作用 30min,室温，PBS洗3min×3次；
- Proteinase K 20ug/ml 37℃ 20min
- PBS洗3min×3次；
- 0.1%Triton×100 PBS洗3min×3次；
- PBS洗3min×3次；
- TUNEL混合液---1ml Tunel缓冲液中加入10ul b-11-DUTP, 10ul TDT, 37C 1h,室温1h
- PBS洗3min×3次；
- Streptavidin-HRP 1:400 37C 30min
10．PBS洗3min×3次；
11．0.04%DAB+0.03%H2O2显色10min，流水洗
12．苏木精衬染1min，盐酸乙醇分化，水洗
13．常规树脂封片
[结果]
阳性结果为棕黄色（核）或棕褐色，背景呈紫蓝色。
我中心开展这项技术已有10余年，工作人员有丰富的经验，为广大的科研朋友在Tunel实验中提供了帮助，为他们争取了宝贵的科研时间。
Tunel（原位末端凋亡法）技术服务
A、实验条件： 切片机(石蜡和冰冻)、Tunel试剂盒（罗氏）
B、交货时间： 15－20天
C、结果提供： 正常和阳性对照玻片及其1张数码照片，剩余石蜡块，检测报告
D、客户提供： 样本
E、样本要求：取材保持组织新鲜（组织块以小于2cm*1.5cm*0.3cm为宜），立即放入固定液（固定液用10%福尔马林液或4%多聚甲醛缓冲液，体积为组织块的10倍以上）中，避免干燥；对于有血迹的样本，可用PBS液或生理盐水冲洗后直接放入固定液中；经固定后的样本必须在48小时内处理
F、收费标准：来电询洽