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AxyPrep 质粒大量试剂盒

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所在地: 北京
有效期至: 长期有效
最后更新: 2017-03-20 12:09
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公司基本资料信息
详细说明
 本试剂盒采用改进的SDS 碱裂解法,结合DNA 制备膜选择性地吸附DNA 的方法达到快速纯化质粒DNA 的目的。适合于从120-300 ml 细菌培养物中提取多至500 μg 高纯的质粒DNA,用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。

一、试剂盒组成、贮存、稳定性

说明书,耗材:大量DNA制备管、大量滤器。

RNase A50 mg/ml,室温密闭贮存

Buffer S1:细菌悬浮液,加入RNase A 后,混合均匀,4°C贮存。

Buffer S2:细菌裂解液(含SDS/NaOH);若出现沉淀,应于37°C温浴溶解并冷却至室温后再室温密闭贮存。

Buffer S3K:中和液,室温密闭贮存。

Buffer BDNA结合溶液,室温密闭贮存。

Buffer W1:洗涤液,室温密闭贮存。

Buffer W2 concentrate:去盐液。使用前,根据瓶上数量加入乙醇,混合均匀,室温密闭用100%乙醇或95%乙醇。

Eluent2.5 mM Tris-HClpH 8.5。室温密闭贮存。

二、注意事项

1. 细菌过量将影响溶菌及质粒DNA的释放。

2. 在步骤3和步骤4中操作必须温和。剧烈摇晃,将导致基因组DNA的污染。但混合必须充分,否则影响得率。

3. 在加入Buffer S3K时,蛋白质和基因组DNA形成粘稠的白色絮状沉淀,必须充分混合均匀,使凝集块中间也得到充分中和凝结。

4. 将洗脱液或水加热至65°C,有利于提高洗脱效率。

5. DNA分子呈酸性,建议在2.5 mM Tris-HClpH 8.5洗脱液中保存。

三、实验准备

1. 第一次使用时,在Buffer W2 concentrate 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。

2. 准备无核酸和核酸酶污染的Tip 头、离心管。

3. 4°C预冷的Buffer S3KBuffer B

四、操作步骤

第一次使用时,将RNase A 全部加入Buffer S1 中,混合均匀,4°C 保存。

1. 120 ml LB 培养基中培养过夜的高拷贝数质粒菌液,或250 ml 过夜培养的低拷贝质粒/Cosmid菌液(若使用丰富培养基,菌液体积应减半或更少),≥3,000×g 离心10 min,弃上清。将离心管倒置于纸巾上数分钟,除尽上清。

2. 10 ml 已加入RNase A Buffer S1 悬浮细菌沉淀,悬浮需均匀,不应留有小的菌块。

3. 10 ml Buffer S2,温和并充分地上下翻转8-10 次混合均匀使菌体充分裂解,直至形成透亮的溶液;此步骤不宜超过5 min

4. 加入10 ml 4°C 预冷的Buffer S3K,温和并充分地上下翻转10-12 次混合均匀,直至形成紧实的凝集块;室温放置5 min

5. 加入10 ml 4°C 预冷的Buffer B,温和并充分地上下翻转10-12 次混合均匀;10,000×g 离心(4°C10 min

6. 正确连接负压装置,将大量DNA 制备管插到负压装置的插口上。

7. 吸取步骤5 中的混合液,转移到大量滤器中,插入注射器芯,垂直向下缓慢推注至大量DNA 制备管中,开启并调节负压至-25-30 英寸汞柱,缓慢吸尽管中溶液。

8. 保持负压,加12 ml Buffer W1,吸尽管中溶液。

9. 14 ml Buffer W2,吸尽管中溶液。

* 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。

10. 将大量DNA 制备管置于50 ml 离心管中,加4 ml Buffer W2 溶液,≥6,000×g 离心5 min

* 可选步骤:将大量制备管插到负压装置的插口上,最大负压吸引10 min 以确保除尽残留的Buffer W2

11. 将大量DNA 制备管置于洁净的50 ml 离心管中,在DNA 制备管的基质上加1.5 ml 水或Eluent,室温静置5 min≥6,000×g 离心5 min 收集质粒DNA

12. 可选步骤:同样方法,在DNA 制备管的基质上加0.75 ml 水或Eluent,室温静置1 min≥6,000×g 离心5 min 收集质粒DNA

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