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高通量测序技术——第二代测序技术

放大字体  缩小字体 发布日期:2012-01-12  浏览次数:1375
核心提示:Roche公司的454测序技术454测序系统是第二代测序技术中第一个商业化运营的测序平台。它的原理是:① 待测DNA文库的构建 把待测序

Roche公司的454测序技术

454测序系统是第二代测序技术中第一个商业化运营的测序平台。它的原理是:

① 待测DNA文库的构建  把待测序列用喷雾法 (nebulization)打断成300-800 bp的小片段并在小片段两端加上不同的接头,或将待测序列变性后用杂交引物进行PCR扩增,连接载体,构建单链DNA(ssDNA)文库。

② Emulsion PCR  将这些ssDNA与水油包被的直径大约28 μm的磁珠在一起孵育、退火,由于磁珠表面含有与接头互补的寡聚核苷酸序列, 因此ssDNA会特异地连接到磁珠上。同时孵育体系中含有PCR反应试剂,因此可以保证每一个与磁珠结合的小片段都会在各自的孵育体系内独立扩增, 扩增产物仍可以结合到磁珠上。反应完成后,破坏孵育体系并富集带有DNA的磁珠。经过扩增反应,每一个小片段都将被扩增大约100万倍,从而达到下一步测序反应所需的模板量。

③ 测序  预先用B a c i l l u sstearothermophilus 聚合酶和单链结合蛋白处理带有DNA的磁珠,然后将磁珠放置在一种叫做PicoTiterPlate(PTP)的平板上。PTP板上含有很多直径约为44 μm的小孔,每个小孔仅能容纳一个磁珠,通过这种方法固定每个磁珠的位置以监测接下来的测序反应。测序反应采用焦磷酸测序法,将一种含有比PTP板上小孔直径更小的磁珠放入小孔,启动测序反应。测序反应以磁珠上大量扩增的ssDNA为模板,每次反应加入一种dNTP进行合成反应。如果这种dNTP能与待测序列配对,则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化酶反应形成ATP。生成的ATP和荧光素酶共同氧化反应体系中的荧光素分子并发出荧光。测序反应产生的荧光信号由放置在PTP板另一侧的CCD照相机记录,再经过计算机分析转换为测序结果。由于每种dNTP在反应中产生的荧光颜色不同,因此可以根据荧光的颜色来确定被测分子的序列。反应结束后,游离的dNTP会在双磷酸酶的作用下降解ATP,导致荧光淬灭,从而使反应体系再生。

Illumina公司的G e n o m e A n a l y z e r

Illumina公司的G e n o m e A n a l y z e r 于2 0 0 6 年问世, 它是一种基于S o l e x a 技术的测序系统。该技术利用边合成边测序的方法(sequence by synthesis, SBS),它的原理是:

① 待测DNA文库的构建把待测序列打断成2 0 0 - 5 0 0bp的小片段,并在小片段两端加上不同的接头,连接载体,构建ssDNA文库。

② D N A 与流动槽( f l o w cell)的附着将这些ssDNA随机地附着在流动槽表面的channel上。流动槽是一种含有8个channel的微纤维板,它的表面固定有很多接头,能支持ssDNA在其表面进行桥式扩增。

③Bridge PCR  向反应体系中添加未标记的核苷酸和酶,进行Bridge PCR扩增反应。Bridge PCR以流动槽表面固定的接头为模板,经扩增将桥型ssDNA扩增成桥型dsDNA。

④ dsDNA的变性  将桥型dsDNA变性成ssDNA,继续扩增。经过不断的扩增变性循环,每一种ssDNA都在各自的位置集中成束(cluster),每一个束含有单个模版分子的500-1000个克隆拷贝,从而达到能支持下一步测序反应所需信号强度的模板量。

⑤ 测序  测序方法采用边合成边测序的方法(SBS)。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP。由于这些dNTP的3´羟基被化学方法保护,因而每轮合成反应都只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后,所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱。加入激发荧光所需的缓冲液,用激光激发荧光信号,用光学设备完成荧光信号的记录,再通过计算机分析转化为测序结果。当荧光信号的记录完成后,加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP的3’羟基保护基团,以便进行下一轮测序反应。

ABI公司的SOLiD技术

ABI公司的SOLiD测序系统于2007年10月投入商业使用,它基于连接酶测序法,即利用DNA连接酶在连接过程中进行测序。它的原理是:

① 待测DNA文库的构建  把待测序列打断成很小的片段,并在小片段两端加上不同的接头,连接载体,构建ssDNA文库。

② Emulsion PCR  与454技术的Emulsion PCR类似,将带接头的ssDNA固定在磁珠表面,进行PCR扩增,并对扩增产物进行3’端修饰。

③ 连接酶测序  将3’端修饰的磁珠沉积于上样玻片(slide),进行连接酶测序。在沉积过程中可对磁珠密度进行调节,以达到最大通量。向体系中加入DNA连接酶、通用测序引物n和具有3’-XXnnnzzz-5’结构的八聚核苷酸。在这个八聚核苷酸中,第1和第2位(XX)上的碱基是确定的,并根据种类的不同在第6-8位(zzz)上加了不同的荧光标记。这种由两个碱基决定的测序方法被称为两碱基测序(two base encoding)。当八聚核苷酸由于第1和第2位配对而被连接酶连接上时,会发出荧光。在记录下荧光信息后,通过化学方法在第5 和第6 位之间进行切割,淬灭荧光信号,以进行下个位置的测序。通过这种方法,每次测序的位置都相差五位,即第一次测第1和第2位,第二次测第6和第7位……在测到末尾后,将新合成的链变性、洗脱。而后用通用测序引物n-1进行第二轮测序。通用测序引物n-1与通用测序引物n的差别是,二者在与接头配对的位置上相差一个碱基,即通用测序引物n-1在通用测序引物n配对位置上向3’端移动了一个碱基。因此在加入DNA连接酶和八聚核苷酸后,可以测定第0和第1位、第5和第6位……第二轮测序完成后,接下来再分别加入通用测序引物n-2、通用测序引物n-3、通用测序引物n-4进行第三轮、第四轮、第五轮测序,最终可以完成全部位置的测定,并且每个位置均被测定了两次。

 
 
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